Bioethanol and Biobased Chemicals from Biomass

            
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Lignocellulose Ethanol - der Kraftstoff der nahen Zukunft
(von Prof. Dr. E. Boles) 

Bioethanol als erneuerbarer Biokraftstoff

Eine der wichtigsten Herausforderungen für unsere heutige Gesellschaft ist es, die wachsende Nachfrage nach Energie zu befriedigen und dabei gleichzeitig die fossilen Rohstoffe durch erneuerbare zu ersetzen und Treibhausgasemissionen zu reduzieren. Da der Kraftstoffverbrauch im Transportsektor mehr als 20% der weltweit genutzten Energie betrifft, besteht in diesem Bereich ein großes Potential für den Einsatz von erneuerbaren Energiequellen. Besonders Biokraftstoffe wie Bioethanol besitzen dabei weltweit einen hohen Stellenwert als Kraftstoffersatz, denn sie können praktisch sofort eine nachhaltige Alternative zu den ölbasierten Kraftstoffen bieten. In der EU sollen bis zum Jahr 2020 10% der Kraftstoffe durch Biokraftstoffe ersetzt werden.

Bioethanol ist ein Kraftstoff, der durch Vergärung von pflanzlichen Rohstoffen gewonnen werden kann. Sein großer logistischer Vorteil ist, dass fast alle vorhandenen Autos mit Ottomotoren "ethanol-fähig" sind und einen Zusatz von bis zu 30% Ethanol zum Benzin ohne Änderung des Motors verwenden können. Durch nur geringfügige Umrüstung oder in den so genannten Flexible Fuel Vehicles (FFVs) können sogar Mischungen bis zu 85% Ethanol / 15% Benzin (= E85) verwendet werden. Bioethanol kann ohne große Anpassungen über die vorhandene Tankstelleninfra¬struktur vertrieben werden. Ethanol wurde bereits in großem Maßstab in Brasilien, den USA und einigen europäischen Ländern eingeführt, und es wird erwartet, dass es in den nächsten 20 Jahren einer der dominierenden erneuerbaren Biokraftstoffe im Transportsektor werden wird.

Klassischer Produktionsprozess von Bioethanol
 
Bioethanol ist Alkohol, der durch Fermentation aus Zuckern mit Hilfe von Mikroorganismen gewonnen wird. Im Allgemeinen wird dazu die Hefe mit dem wissenschaftlichen Namen Saccharomyces cerevisiae eingesetzt. Die Zucker stammen aus Pflanzen, die durch den Prozess der Photosynthese die Energie des Sonnenlichtes ausnutzen, um aus Kohlendioxid (CO2) ihre organischen Bestandteile aufzubauen. Die Zucker können in Form von Stärke (z.B. Getreidekorn, Kartoffel) oder Saccharose (z.B. Zuckerrübe, Zuckerrohr) gespeichert werden, oder sie werden in Strukturbestandteile (z.B. Cellulose) umgewandelt, die der Pflanze ihre Form und Stabilität verleihen. Die gegenwärtige Produktion von Bioethanol wird mit Hilfe der Technologien der sogenannten 1. Generation durchgeführt. Dabei werden vorwiegend Saccharose aus Zuckerrohr und Zuckerrüben oder Glukose aus Stärke, die aus Mais oder Getreide gewonnen wird, eingesetzt. Dabei ist vor allen Dingen der brasilianische Ethanol deshalb so preiswert, weil die Hefen die Saccharose des Zuckerrohrs direkt zu Ethanol vergären können, während die Stärke des Getreides zunächst in einem vorgeschalteten Prozess in Zucker aufgespalten („hydrolysiert“) werden muß. Das geschieht mittels speziellen Enzymen. Nach Destillation und Trocknung kann Ethanol dann als Autokraftstoff eingesetzt werden. Mit Ausnahme der hocheffizienten brasilianischen Ethanol-Produktion aus Zuckerrohr sind der Netto-Energiegewinn und die Vorteile der CO2-Emissionen von Biokraftstoffen der 1. Generation weiterhin umstritten und z. T. unbefriedigend. Darüber hinaus gibt es ökologische sowie ethisch-soziale Bedenken, große Landflächen sowie Nahrungsmittel zur Produktion von Kraftstoffen einzusetzen.

Ethanol aus lignocellulosischer Biomasse
  
Bioethanol aus Getreide kann daher nur eine Übergangslösung darstellen. Der einzige Ausweg aus diesem Dilemma ergibt sich bei der Nutzung von pflanzlichen Reststoffen, wie Stroh, Holzresten oder Landschaftspflegegut, die zudem noch äußerst billig zu haben sind, oder aus dem Anbau von Energiepflanzen wie Switchgras oder Miscanthus, die keiner intensiven landwirtschaftlichen Bewirtschaftung bedürfen und auch auf minderwertigen Böden wachsen. Pflanzenreste oder Energiepflanzen besitzen nur wenig Stärke oder Saccharose sondern enthalten Zucker in Form von Lignocellulosen in ihren Zellwänden eingelagert. Lignocellulosen bestehen aus Cellulose, Hemicellulosen und dem nicht fermentierbaren Lignin („Holzstoff“). Cellulose ist wie die Stärke ein Polymer aus Zuckermolekülen mit sechs Kohlenstoffatomen, der Glucose, die zu langen Ketten miteinander verknüpft sind. Beide unterscheiden sich nur in der Art der Verknüpfungen. Hemicellulosen bestehen zum größten Teil aus Zuckern mit fünf Kohlenstoffatomen, Xylose und Arabinose, die in verzweigten Ketten aneinandergelagert werden. Um aus Lignocellulose Bioethanol herstellen zu können, müssen zunächst die Cellulose und die Hemicellulosen in die einzelnen Zucker gespalten werden. Das geschieht mit Säuren oder Laugen und speziellen Enzymen. Danach müssen Mikroorganismen das Gemisch aus Glucose, Xylose und Arabinose zu Ethanol fermentieren. Die Fermentation, Destillation und Trocknung geschieht analog zum klassischen Bioethanol-Prozess der 1. Generation. Insgesamt besteht der Gesamtprozess im Wesentlichen aus vier technologischen Teilprozessen: Vorbehandlung des lignocellulosischen Rohmaterials, Hydrolyse der Kohlenhydratpolymere zu Zuckern, Fermentation aller Zuckerarten zu Ethanol mit Hilfe von Mikroorganismen sowie Destillation/Separation des Ethanols.

Trotz der großen Ähnlichkeiten in der Stärke- und Lignocellulose-Fermentation gilt es bei der letzteren einige Probleme in den Griff zu bekommen. In den beiden ersten technologischen Teilprozessen muss zunächst die Lignocellulose verflüssigt und verzuckert werden. Dieses ist deutlich schwieriger als bei der Stärke, da die Zuckerketten nur schwer zugänglich sind. Das Pflanzenmaterial muss deshalb zunächst chemisch oder thermisch vorbehandelt werden. Dafür stehen mehrere Optionen zur Verfügung. Favorisiert wird gegenwärtig die Vorbehandlung durch hohe Temperaturen (~ 200°C) unter leicht sauren Bedingungen. Diese Methode birgt jedoch die Gefahr, dass dabei Substanzen entstehen, die in der anschließenden enzymatischen Hydrolyse und der Fermentation zum Ethanol die Enzyme und/oder Mikroorganismen inhibieren oder sogar schädigen. Erst nach der Vorbehandlung kann die Verzuckerung mit Hilfe von speziellen Enzymen (Cellulasen, Xylanasen, Glucosidasen) geschehen, die analog den Amylasen bei der Stärke die Lignocelluloseketten in freie Zucker spalten. Diese Enzyme werden aus Pilzen oder Bakterien gewonnen, die in der Natur an der Verrottung von Pflanzenresten beteiligt sind. Da wesentlich mehr Enzyme als bei der Stärkeverzuckerung benötigt werden, führt dies zu erhöhten Kosten. Enorme Forschungsanstrengungen haben hier in den letzten Jahren jedoch zu einer deutlichen Kostenreduzierung geführt.

Der zweite wesentliche Unterschied liegt darin, dass in der Lignocellulose nicht wie in der Stärke nur Glucose als Zuckerbaustein vorhanden ist, sondern auch andere Zucker wie Xylose und Arabinose. Diese können jedoch von den zur klassischen Ethanolproduktion verwendeten Hefen nicht genutzt werden. Es müssen also speziell gezüchtete Mikroorganismen eingesetzt werden, die neben der Glukose auch die anderen Zucker zu Ethanol vergären können. Dies wird unten noch im Detail beschrieben.

Ein dritter Unterschied sind toxische Stoffe, die bei der chemischen Vorbehandlung des Pflanzenmaterials entstehen (z.B. Furfurale oder Essigsäure). Diese Inhibitoren schädigen die bei der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen und müssen theoretisch vorher entfernt werden. Dies verursacht zusätzliche Kosten. Ein Ausweg ist es, Inhibitor-tolerante Mikroorganismen einzusetzen.

Ein vierter wesentlicher Unterschied ist das niedrigere Raumgewicht von Pflanzenabfällen, d.h. die niedrigere Energiedichte gegenüber Getreide- oder Maiskörnern. Dieses bedeutet erhöhte Transportkosten und einen erhöhten Lagerraumbedarf. Dieses Problem könnte jedoch durch effizientere Presstechniken, den Transport von bereits zerkleinertem Material und kleineren, dezentralen Produktionsanlagen gelöst werden

Vergärung der C5-Zucker Xylose und Arabinose
 
Wie bereits oben angeführt, besteht die pflanzliche Biomasse zu einem Grossteil aus Zuckern mit sechs und solchen mit fünf Kohlenstoffatomen (C6/Hexose- und C5/Pentose-Zucker). In der Natur gibt es nun jedoch keine geeigneten Organismen, die alle diese Zucker vollständig zu Ethanol vergären könnten. Aus diesem Grunde bedurfte es einiger Anstrengungen, um einen Mikroorganismus zu züchten, der alle Zucker mit hoher Ausbeute zu Ethanol vergären kann. In der traditionellen Ethanolproduktion werden ausschließlich Hefen vom Typ Saccharomyces eingesetzt. Das sind die gleichen Hefen, die auch zur Herstellung von Brot, Bier und Wein dienen. Diese können jedoch die C5-Zucker Xylose und Arabinose nicht zu Ethanol vergären. Wie wichtig aber die Umsetzung aller Zucker für eine wirtschaftliche Vergärung von pflanzlicher Biomasse ist, sei hier am Beispiel von Getreidestroh gezeigt.

In Deutschland fallen pro Jahr durchschnittlich 30 Millionen Tonnen Getreidestroh an. Im Rahmen des BMU-Förderprogrammes „Energetische Biomassenutzung“ zeigte kürzlich eine Studie, dass davon ca. 10 Millionen Tonnen für Bioenergiegewinnung pro Jahr nachhaltig verfügbar wären. Stroh enthält etwa 32 % Glucose, 19 % Xylose und 2,4% Arabinose. In 1 t Stroh sind also 320 kg Glucose enthalten. Bei einer vollständigen Vergärung entstehen daraus etwa 160 kg Ethanol, was einem Volumen von 200 l entspricht. Die vollständige Vergärung des Pentosezuckers Xylose ergibt entsprechend zusätzliche 124 l Ethanol pro Tonne Stroh. Insgesamt könnten also allein in Deutschland pro Jahr aus der gebundenen Glucose des Reststrohs etwa 2 Mrd. Liter Ethanol gewonnen werden. Die Vergärung der in den Pflanzenabfällen vorhandenen Xylose ergäbe zusätzliche 1,25 Mrd. Liter Ethanol. Selbst die prozentual gesehen recht kleine Menge an Arabinose liefert immerhin noch 150 Mio. Liter Ethanol. Da die Margen in einem Markt wie den Biokraftstoffen recht eng sind, ist es für einen wirtschaftlich sinnvollen Prozess essentiell möglichst alle vorhandenen Zuckerarten in Ethanol umzuwandeln. D.h. alleine mit dem aus Reststroh gewonnenen Lignocellulose-Ethanol ließen sich mehr als 10% der Ottokraftstoffe in Deutschland ersetzen. Rechnet man dann noch Holzabfälle, kommunale Bioabfälle, Landschaftspflegegut oder speziell angebaute Energiepflanzen dazu, dann kommt man leicht auf Werte über 30%.

Es gibt verschiedene Mikroorganismen, die für die Bioethanolproduktion aus Lignocellulose in Frage kommen. Wir haben kürzlich die Vor- und Nachteile dieser Mikroorganismen zusammengefasst und gegenübergestellt (Weber et al. 2009). Es stellt sich dabei und aus Sicht der Industrie klar heraus, dass Hefen, insbesondere die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, der für großtechnische Prozesse am besten geeignete und auch präferierte Ethanol-produzierende Mikroorganismus ist. Insbesondere seine exzellenten Prozesseigenschaften und die Tatsache, dass nahezu alle Ethanolproduktionsprozesse der 1. Generation auf der Bäckerhefe beruhen, favorisieren S. cerevisiae auch für die Produktion von Lignocellulose-Ethanol. Die entscheidenden Vorteile von S. cerevisiae sind seine generelle Prozessrobustheit, die Toleranz gegenüber toxischen und inhibitorischen Substanzen, die bei der Vorbehandlung und Hydrolyse der Biomasse entstehen, sowie die Toleranz gegenüber hohen Zucker-, Ethanol- und Säurekonzentrationen. Insbesondere die Säuretoleranz und die Tatsache, dass Fermentationen mit S. cerevisiae bei niedrigen pH-Werten ablaufen sind für großtechnische Prozesse wie die Ethanolherstellung von starker Bedeutung, da sie die Kontaminationsgefahr im Prozess deutlich verringern. Weiterhin ist bei S. cerevisiae die Infektionsgefahr durch Viren vernachlässigbar im Vergleich zur hohen Infektionsgefahr durch Phagen bei einigen Bakterien. Andere Bakterien wiederum benötigen den Prozess komplizierende und verteuernde Erfordernisse, wie z.B. strikt anaerobe Bedingungen oder den Zusatz von Nahrungssupplementen. Neben der Bäckerhefe wurden in letzter Zeit auch einige nicht-konventionelle Hefen für die Produktion von Lignocellulose-Ethanol ins Spiel gebracht. Größte Probleme mit diesen Hefen sind jedoch niedrigere Ethanolerträge oder langsamere Fermentationsraten, die Unfähigkeit unter strikt anaeroben Bedingungen zu fermentieren sowie höhere Empfindlichkeit gegenüber toxischen Hydrolysatkomponenten oder dem Endprodukt Ethanol.

Alle diese Nachteile der anderen Mikroorganismen sind deutlich schwieriger zu verbessern bzw. anzupassen als die wenigen existierenden Unzulänglichkeiten von S. cerevisiae. Daher sind in den letzten Jahren viele Firmen, insbesondere in den USA, die zunächst verstärkt auf den Einsatz von Bakterien in der Biokraftstoffproduktion der 2. Generation gesetzt hatten, auf S. cerevisiae umgeschwenkt. Der wesentliche Nachteil von S. cerevisiae ist seine Unfähigkeit, die bei der Lignocellulose-Hydrolyse anfallenden Pentosen zu vergären. Verschiedene Forschergruppen aus Europa und den USA, unter anderem auch meine Arbeitsgruppe von der Goethe-Universität Frankfurt zusammen mit der von mir mitgegründeten Firma Butalco GmbH, haben in den letzten Jahren Hefestämme züchten können, die auch C5-Zucker zu Ethanol vergären.

Aus dem Erbmaterial der Hefe lässt sich ablesen, dass diese früher einmal in der Lage war, C5-Zucker zu verwerten. Sie hat diese Eigenschaft allerdings im Laufe ihrer Evolution wieder verloren. Mit Hilfe moderner biologischer Verfahren gelang es nun jedoch, den Hefezellen diese Eigenschaft wieder zu verleihen bzw. sie sogar deutlich zu verbessern. Dazu wurde ihnen gezielt das entsprechende Erbmaterial aus anderen Hefen, Pilzen und Bakterien angeboten. Solch ein so genannter horizontaler Gentransfer ist in der Natur ein normaler Prozess, und hat über die Jahrmillionen zu der Vielfalt an Organismen geführt, die wir heute kennen. Auch die Hefezellen besitzen von Natur aus Erbmaterial, das sie im Laufe ihrer Entwicklung von anderen Organismen erworben haben. Im Falle der C5-Zucker vergärenden Hefen konnte dieser Prozess nun in einer deutlich verkürzten Zeit nachgestellt werden. Dabei sind Hefezellen entstanden, die sowohl C6- als auch C5-Zucker vergären können. Im Falle des C5-Zuckers Xylose wurden dazu zwei verschiedene Strategien angewandt. Zunächst wurde ein 2-Schritt Mechanismus (Xylose-Reductase/Xylitol-Dehydrogenase aus Pichia stipitis) ausgenutzt, um Xylose in den Stoffwechsel der Bäckerhefe einzuschleusen. Den Hefen wurden einfach die entsprechenden Gene aus P. stipitis eingesetzt. Dadurch konnten sie die Xylose zwar nutzen und auch in Ethanol umwandeln, stauten jedoch signifikante Mengen des Nebenproduktes Xylitol an, welches die Ethanolausbeuten deutlich verringerte. Im Gegensatz dazu konnte meine Arbeitsgruppe kürzlich erfolgreich Hefen züchten, die Xylose direkt in einem Schritt mit Hilfe des Enzyms Xylose-Isomerase in ihren Stoffwechsel integrieren und zu Ethanol vergären können (Brat et al. 2009). Das Gen für die Xylose-Isomerase konnten wir aus einem Bakterium isolieren, dann mit Hilfe von synthetischer DNA an den „genetischen Dialekt“ der Hefe anpassen und schließlich erfolgreich dazu einsetzen, die Hefen zur effizienten Produktion von Ethanol aus Xylose zu veranlassen.

Im Falle des C5-Zuckers Arabinose stellte sich der häufig in Pilzen zu findende 5-stufige Abbauweg in den Saccharomyces-Hefen als wenig geeignet heraus. Dagegen konnte meine eigene Arbeitsgruppe erfolgreich einen 3-stufigen Stoffwechselweg etablieren, der sonst nur in Bakterien zu finden ist (Becker und Boles 2003, Wiedemann und Boles 2008). Integrierte man diesen Stoffwechselweg in die Hefen und zwang sie dann mehrere Monate lang, Arabinose als einzige Energiequelle zu nutzen, dann entwickelten sich tatsächlich Hefestämme, die neben der Glucose auch Arabinose vergären konnten.

Als nächstem Schritt galt es dann, die im Labor erzielten Erfolge für den industriellen Einsatz weiterzuentwickeln. Die im Laboralltag benutzten Hefestämme sind zwar sehr gut geeignet, die verschiedenen Vergärungsstrategien zu erforschen, sie sind jedoch meist für industrielle Anwendungen weniger brauchbar. Zum einen sind die Laborhefen nicht stabil genug und verlieren ihre erworbenen Fähigkeiten sehr schnell wieder, zum anderen sind sie zu empfindlich gegenüber toxischen Substanzen (Essigsäure, Furfurale), die bei der chemischen Vorbehandlung des Pflanzenmaterials entstehen. Daher haben wir im weiteren robuste Industriehefen entwickelt, die unter industriellen Bedingungen effizient lignocellulosische Hydrolysate vergären und dabei alle Zucker, also Glucose, Xylose und Arabinose zusammen zu Ethanol umwandeln können.

Ausblick
 
Insgesamt bleibt also festzuhalten, dass alle wesentlichen Voraussetzungen für einen Lignocellulose-Ethanol Prozess vorhanden sind. Nun gilt es nur noch, diesen in die Wirklichkeit zu überführen und an der weiteren Effizienzsteigerung zu arbeiten. Die größten Kosten sind immer noch die Enzymkosten zur Celluloseverzuckerung. Enzymhersteller verweisen jedoch darauf, dass es bereits deutliche Kostenreduzierungen für immer effektivere Enzyme gibt. Und wenn die ersten kommerziellen Anlagen laufen, wird die Nachfrage steigen und die Enzyme werden preiswerter werden. Für die Fermentation wäre es wichtig, dass alle Zucker gleichzeitig vergoren werden. Unsere Hefen können zwar C6- und C5-Zucker vergären, die C5-Zucker werden jedoch erst dann vergoren, nachdem die C6-Zucker in der Fermentationsbrühe aufgebraucht sind. Eine Co-Fermentation von C6- und C5-Zuckern würde die Fermentationszeit verringern und damit zu deutlichen Kosteneinsparungen führen. Dieses Problem wird durch die Konkurrenz der Zucker bei der Aufnahme in die Hefezellen bedingt und wir arbeiten bereits an einer Lösung, um mit spezifischen C5-Zuckertransportern eine gleichzeitige Fermentation aller Zuckerarten zu erreichen (Subtil und Boles 2011).

Literatur

Becker J and Boles E (2003). A modified Saccharomyces cerevisiae strain that consumes L-arabinose and produces ethanol. Appl Environ Microbiol 69, 4144-4150.

Brat D, Boles E and Wiedemann B (2009). Functional expression of a bacterial xylose isomerase in Saccharomyces cerevisiae. Appl Environ Microbiol 75, 2304-2311.

Subtil T and Boles E (2011). Improving L-arabinose utilization of pentose fermenting Saccharomyces cerevisiae cells by heterologous expression of L-arabinose transporting sugar transporters. Biotechnology for Biofuels 4, 38.

Weber C, Farwick A, Benisch F, Brat D, Dietz H, Subtil T and Boles E (2010). Trends and challenges in the microbial production of lignocellulosic bioalcohol fuels. Appl Microbiol Biotechnol 87, 1303-1315.

Wiedemann B, Boles E (2008). Codon-optimized bacterial genes improve L-arabinose fermentation in recombinant Saccharomyces cerevisiae. Appl Environ Microbiol 74, 2043-2050.

 
          

(Hinweis: dieser Artikel ist urheberrechtlich geschützt und darf ohne schriftliche Genehmigung von E. Boles weder kopiert noch auf andere Art und Weise verbreitet oder sonstwie vervielfältigt werden, weder als Ganzes und auch nicht teilweise oder in Auszügen)

What is Lignocellulosic Ethanol?

Lignocellulose is a component of plant residues. It consists of lignin, cellulose and hemicelluloses.  Cellulose consists primarily of glucose. Hemicelluloses consist to a considerable portion of the pentosesugars xylose and arabinose. In order to be able to convert lignocellulose to bioethanol, the cellulose and the hemicelluloses must first be split ("hydrolyzed") into the individual sugars. That can be done with acids and special enzymes. Afterwards, the yeasts must ferment the mixture from glucose, xylose and arabinose to ethanol. Unfortunately, normal yeasts cannot metabolize xylose and arabinose.

During the last years however, using the methods of genetic engineering, yeasts have been "designed" which are able to ferment such sugar mixtures (see Information from University Frankfurt am Main). Although these yeasts are still not perfect for industrial applications, considerable progress is expected during the next years. Thus, a bioethanol production process should become reality which is not only more economical but also more environment-friendly than the traditional process.

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